In vivo CAR-T 浪潮已至（三）：载体只找 T 细胞？多谱系重建才是脱靶毒性评价的照妖镜

前两篇中，我们分别介绍了in vivo CAR-T体外评价的三层关卡——编辑效率、靶向特异性和功能活性，以及如何根据递送系统和研究阶段选择合适的体内重建模型。体外筛选帮我们找到"转得进去、杀得精准"的候选分子，体内模型帮我们验证真实生理环境下的抗肿瘤效果。

 

但有一个问题始终悬而未决：递送系统进入体内后，随血液循环游走全身，它真的只会转染T细胞吗？如果B细胞、NK细胞、髓系细胞也被带上了CAR，会发生什么？

 

这就是非目标细胞脱靶毒性——in vivo CAR-T安全性评价中容易被忽视、却可能决定临床成败的关键一环。

 

一、为什么脱靶毒性不容忽视？

 

In vivo CAR-T的核心逻辑是"在体内把T细胞改造成CAR-T"。但无论是LNP还是病毒载体，给药后都要经过血液循环，接触到的远不止T细胞——脾脏、淋巴结、骨髓里分布着大量B细胞、NK细胞、单核细胞和巨噬细胞。

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上篇的体外数据已经给出了明确信号：在PBMC培养体系中，in vivo CAR-T药物转染后，不仅可在T细胞上高效表达CAR，在B细胞、NK细胞乃至单核细胞上也都能检测到不同程度的转导。这意味着，"载体只找T细胞"只是一个理想假设，真实情况要复杂得多。

 

非目标细胞一旦表达CAR，潜在风险不容忽视：

 

• B细胞表达CAR：CAR分子可能遮蔽B细胞自身的CD19等抗原表位，干扰CAR-T对靶细胞的正常识别，甚至导致B细胞功能异常；

 

• NK细胞表达CAR：可能引发NK细胞异常活化，介导非特异性杀伤，打破免疫平衡；

 

• 髓系细胞表达CAR：单核/巨噬细胞被异常激活后，可能大量释放IL-6、IL-1β、TNF-α等促炎因子，升高细胞因子释放综合征（CRS）风险。

 

体外实验能让我们看到"有没有转导"，但转导之后这些细胞在体内会发生什么、会不会引发级联免疫反应、对正常组织有多大损伤——这些问题，只能在具备完整免疫细胞谱系的动物模型中找到答案。

 

二、现有脱靶模型评价的盲区：免疫细胞重建不全

 

评价脱靶毒性的前提，是模型里得有这些"非目标细胞"。但目前常用的两种人源化重建模型，在免疫细胞谱系覆盖上都存在天然局限：

 

• huPBMC-NCG：重建速度快，T细胞功能良好，但B细胞重建有限，NK细胞和髓系细胞几乎检测不到，且受GvHD限制观察窗口期较短；

 

• huHSC-NCG：T细胞、B细胞重建较完整，长期稳定性好，但由于小鼠细胞因子与人源细胞的种属差异，髓系细胞发育非常有限，NK细胞几乎无法重建。

 

换句话说，这两种模型里"没有"足够的NK细胞和髓系细胞——既然细胞都不存在，自然就无法评价载体对这些细胞的脱靶转导和后续毒性。这不是模型不够好，而是评价维度天然受限。对于需要全面评估脱靶谱的in vivo CAR-T项目来说，这个盲区必须补上。

表1. huPBMC-NCG、huHSC-NCG与huHSC-NCG-M/hIL15模型对比

 

三、解决方案：huHSC-NCG-M/hIL15，多谱系全重建

 

药康生物自主开发的huHSC-NCG-M/hIL15小鼠（品系编号T066463），正是为解决这一问题而生。

 

该模型在NCG重度免疫缺陷背景上，通过基因敲入同时稳定表达人源SCF（KITLG）、GM-CSF（CSF2）、IL-3和IL-15四类细胞因子：

 

• SCF、GM-CSF、IL-3（NCG-M模块）：促进人源髓系细胞的发育与扩增，弥补常规HSC-NCG模型髓系重建不足的短板；

 

• hIL-15：支持人源NK细胞的定植、增殖与活化，这是常规模型几乎无法重建NK细胞的关键突破。

 

四类因子协同作用，使huHSC-NCG-M/hIL15能够同时重建出功能性T细胞、B细胞、NK细胞以及巨噬细胞等髓系细胞，构建起更接近人类真实免疫组成的体内环境。

 

验证数据显示：

 

• HSC重建6周时，外周血hCD45+白细胞水平已达25%以上，人源免疫细胞植入效率高；

 

• 与huHSC-NCG相比，huHSC-NCG-M/hIL15的髓系细胞水平更高且更稳定；

 

• NK细胞重建优势显著——huHSC-NCG和huHSC-NCG-M中几乎检测不到NK细胞，而huHSC-NCG-M/hIL15中NK细胞清晰可辨；

 

• 功能层面，脾脏中分离的人NK细胞可有效介导ADCC效应，并产生更多Granzyme B；T细胞也表现出更强的TNFα分泌能力，说明重建的免疫细胞不仅"存在"，而且"有功能"。

 

图2. huHSC-NCG-M/hIL15小鼠外周血中T、B、NK及髓系细胞的重建情况

 

四、多谱系模型如何评价脱靶毒性？

 

有了完整的免疫细胞谱系，脱靶毒性评价就可以从"有没有"升级为"有多少、有什么后果"：

 

① 全谱系CAR表达检测：给药后不同时间点采血，通过流式分群检测T细胞、B细胞、NK细胞、单核/巨噬细胞各亚群的CAR阳性率，绘制完整的体内脱靶谱，直观反映载体的靶向选择性；

 

② 非目标细胞功能评估：检测被转导的非目标细胞是否出现异常活化标志、细胞因子分泌变化，判断脱靶是否带来功能性后果；

 

③ 安全性终点监测：结合体重变化、GvHD评分、血清中IFN-γ、IL-6、TNF-α等CRS相关细胞因子水平，系统评估脱靶引发的全身毒性；

 

④ 长期安全性观察：利用HSC重建模型长期稳定的优势，持续观察多谱系共存环境下是否出现迟发性免疫紊乱或组织损伤。

 

图3. 多谱系人源化模型脱靶毒性评价流程

 

五、不止于脱靶：多谱系重建让CRS评价更接近真实

 

除了脱靶毒性，huHSC-NCG-M/hIL15还有一层容易被忽略的价值——它可能更适合评价in vivo CAR-T诱导的细胞因子释放综合征（CRS），尤其是IL-6的产生。

 

CRS的核心效应因子是IL-6，而IL-6的主要来源不是T细胞，而是被激活的巨噬细胞和单核细胞等髓系细胞。经典的炎症级联是：CAR-T活化后释放IFN-γ和TNF-α，进而激活髓系细胞，由后者大量释放IL-6、IL-1β放大全身炎症。T细胞是"启动者"，髓系细胞才是IL-6的"主力生产者"。

 

这恰恰是现有模型的短板——huPBMC-NCG和huHSC-NCG的髓系细胞重建非常有限，IL-6的主要来源不足，即使T细胞活化也难以触发完整的下游级联，检测到的细胞因子谱往往以IFN-γ为主，IL-6水平偏低。

 

huHSC-NCG-M/hIL15的多谱系重建补上了这一缺口：NCG-M模块促进巨噬细胞和单核细胞发育，为IL-6提供了细胞来源；重建的T细胞功能活跃，可释放IFN-γ和TNF-α启动级联；hIL-15支持下的NK细胞功能活跃，可能通过与巨噬细胞的交互进一步放大炎症信号。三者协同，使"CAR-T活化→髓系细胞响应→IL-6释放"这一CRS核心级联有了完整的细胞基础。

 

目前，药康正基于该系列模型开展血清 IL-6/IL-1β/IFN-γ 动态谱、髓系细胞活化与 IL-6 的关联、以及不同载体间 CRS 风险差异等方向的评价数据收集，相关结果待数据完善后公布。

 

图4. CRS炎症级联机制：CAR-T→IFN-γ/TNF-α→巨噬细胞→IL-6/IL-1β，及不同人源化模型的细胞覆盖对比

 

从体外三层关卡筛选最优分子，到体内选择合适模型验证药效，再到用多谱系重建模型系统评价非目标细胞脱靶毒性和CRS风险——in vivo CAR-T的临床前评价体系正在一步步走向完整。

 

一个真正优秀的in vivo CAR-T候选分子，不仅要"杀肿瘤杀得准"，还要"对正常免疫细胞不伤及无辜"，更要"不引发失控的炎症风暴"。脱靶毒性和CRS评价，共同守护着这条安全底线。

 

药康生物依托NCG系列人源化模型平台，提供从体外分子筛选、体内药效验证到多谱系脱靶毒性与CRS评价的全链条服务，为in vivo CAR-T的研发保驾护航。从体外到体内，从药效到安全，每一步走得稳，临床才能走得远。‘’