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江苏集萃药康生物科技股份有限公司
入驻年限：7 年
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药康生物
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抗体、细胞库 / 细胞培养、技术服务、试剂、耗材、实验室仪器 / 设备
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公司新闻/正文
我的基因敲除小鼠模型为什么Western检测仍有蛋白条带？
3394 人阅读发布时间：2022-09-23 11:10
我的敲除小鼠模型为什么Western检测仍有蛋白条带？遇到此类问题时，不要惊慌，让我们一起来抽丝剥茧，逐一排查直至揭露问题的真相。
1.首先对我们的敲除方案进行分析：
仔细查看我们设计的敲除区域位置，看看该敲除方案是否会将目的基因的所有的转录本都破坏掉。偶尔我们也会发现数据库内的基因转录本数据有更新，原先设计的理想敲除方案匹配新的数据库后，有转录本未被破坏的情况。
或者，查看目标区域被敲除后，是否可在敲除区域后面找到翻译起始密码(ATG)，并且与正确的蛋白序列是对框的。若能找到，那么确实有可能翻译出有功能的蛋白。
分析完设计方案后，再根据具体情况来设计以下实验，辅助进行问题原因的排查。
2.检测确认小鼠模型的基因是否被正确敲除：
在敲除区域的上、下游设计PCR扩增引物，提取小鼠的基因组DNA作为模板进行PCR反应，对扩增出的条带进行测序分析，确认敲除区域是否跟预期的完全一致。
3.检测确认敲除区域是否完全丢失：
进行此步检测的原因是因为利用Cas9 技术制作的敲除模型，会有低概率发生敲除的基因片段再度插入到基因组中的现象。
检测方法是在敲除区域的内部设计一对qPCR引物或普通PCR引物，对敲除小鼠的基因组DNA样品进行检测，检测敲除区域是否已完全丢失。
进行此步检测的原因是因为利用Cas9 技术制作的敲除模型，会有低概率发生敲除的基因片段再度插入到基因组中的现象。
检测方法是在敲除区域的内部设计一对qPCR引物或普通PCR引物，对敲除小鼠的基因组DNA样品进行检测，检测敲除区域是否已完全丢失。
或者也可以用高度表达组织的RNA样品，在敲除区域内的编码exon上设计引物进行RT-PCR或RT-qPCR实验，检测敲除区域是否仍然有mRNA被转录出来。
4.检测RNA转录后的外显子剪接是否按照预期发生：
若基因的敲除区域不大，可检测敲除小鼠的RNA是否按照预期方式进行外显子拼接，以便确认是否会发生蛋白翻译框的移码。
检测方法是选择该基因高度表达的组织，提取RNA样品进行RT-PCR并测序，确认RNA编码区的序列是否跟预期相符。
5.分析Western目的条带：
若基因已经敲除了一大段了，但是抗体仍能杂出来目的条带，那可真是活见鬼了。这有可能是抗体特异性不好的原因。如果要确认这种情况，可将Western的目的条带进行质谱分析，检测其序列是否与我们要敲除的目标蛋白一致。
4.检测RNA转录后的外显子剪接是否按照预期发生：
若基因的敲除区域不大，可检测敲除小鼠的RNA是否按照预期方式进行外显子拼接，以便确认是否会发生蛋白翻译框的移码。
检测方法是选择该基因高度表达的组织，提取RNA样品进行RT-PCR并测序，确认RNA编码区的序列是否跟预期相符。
5.分析Western目的条带：
若基因已经敲除了一大段了，但是抗体仍能杂出来目的条带，那可真是活见鬼了。这有可能是抗体特异性不好的原因。如果要确认这种情况，可将Western的目的条带进行质谱分析，检测其序列是否与我们要敲除的目标蛋白一致。