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药康生物
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小鼠研究院丨关于小鼠胚胎培养液 多的是你不知道的事
1751 人阅读发布时间：2023-03-31 14:38
小鼠胚胎的体外培养成功最重要的条件之一是胚胎培养液。目前市场上已经有多种小鼠胚胎培养液，常用的有M16、CZB、 KSOM、G1-G2等。
小鼠胚胎移植培养液配方演变图
如何选择培养液？它们的的区别是什么？关键成分是什么？
今天小编带您解读小鼠胚胎培养液的演变史。
小鼠胚胎移植培养液的发展历程:
小鼠胚胎移植培养液配方演变图
1932年，培养液是最初由Krebs 及Henseleit配制的Krebs–Ringer 碳酸氢盐溶液（KRB)是最早模拟体内细胞的生存环境的盐溶液。但是，并没有任何时期的胚胎在这些培养液中成功地发育。
1、能量成分的添加演变
1956年，Wes Whitten在Krebs–Ringer盐溶液的基础上添加了葡萄糖和BSA后，为8细胞发育至囊胚的培养发育配制了第一个培养基。Whitten后来在他的初始培养基中加入了乳酸（乳酸钠或乳酸钙），扩大了胚胎体外发育的范围可以从2细胞开始发育至囊胚。但是，还不能从原核发育至2细胞。再后来Biggers, Whittingham及Donohue 发现培养液中添加丙酮酸后可以支持胚胎从原核发育至2细胞。多年来，丙酮酸一直都是作为哺乳动物受精卵的第一次卵裂的能量来源。
以上培养基的改变都是添加了能量基底物质（葡萄糖，乳酸，丙酮酸），而盐离子的成分与Krebs–Ringer盐溶液并没有差别。
1、能量成分的添加演变
1956年，Wes Whitten在Krebs–Ringer盐溶液的基础上添加了葡萄糖和BSA后，为8细胞发育至囊胚的培养发育配制了第一个培养基。Whitten后来在他的初始培养基中加入了乳酸（乳酸钠或乳酸钙），扩大了胚胎体外发育的范围可以从2细胞开始发育至囊胚。但是，还不能从原核发育至2细胞。再后来Biggers, Whittingham及Donohue 发现培养液中添加丙酮酸后可以支持胚胎从原核发育至2细胞。多年来，丙酮酸一直都是作为哺乳动物受精卵的第一次卵裂的能量来源。
以上培养基的改变都是添加了能量基底物质（葡萄糖，乳酸，丙酮酸），而盐离子的成分与Krebs–Ringer盐溶液并没有差别。
2、盐离子成分的调整演变
1960s至1970s早期，一系列胚胎培养液经过多年的发展改革，包括被视为胚胎培养标准培养液的由Whittingham配制的M16培养液。M16的无机盐离子浓度本质上与KRB盐溶液没有区别，只是用NaCl替换了同等浓度的乳酸钠降低了Cl⁻以及Ca2+的数量。这些培养液的发明和改进不仅极大的促进了实验胚胎学的发展，而且为第一代人类胚胎培养液的发展起到重大的作用，比如HTF的产生。
CZB是由Chatot, Ziomek, Bavister及其同事们共同配制并用他们的名字命名，CZB与M16类似，但是在一些关键成分上有所不同。在M16的基础上引入了谷氨酰胺，EDTA，降低了NaCl，提高了乳酸/丙酮酸的比值。但是，此时的CZB还必须分成2步使用来克服随机繁育的小鼠胚胎发育阻滞问题，因为葡萄糖存在可能会造成2细胞发育阻滞，因此葡萄糖在4细胞至8细胞阶段引入。经过长时间的研究，现在的CZB已经发展到不需要分成2步来培养胚胎。
1960s至1970s早期，一系列胚胎培养液经过多年的发展改革，包括被视为胚胎培养标准培养液的由Whittingham配制的M16培养液。M16的无机盐离子浓度本质上与KRB盐溶液没有区别，只是用NaCl替换了同等浓度的乳酸钠降低了Cl⁻以及Ca2+的数量。这些培养液的发明和改进不仅极大的促进了实验胚胎学的发展，而且为第一代人类胚胎培养液的发展起到重大的作用，比如HTF的产生。
CZB是由Chatot, Ziomek, Bavister及其同事们共同配制并用他们的名字命名，CZB与M16类似，但是在一些关键成分上有所不同。在M16的基础上引入了谷氨酰胺，EDTA，降低了NaCl，提高了乳酸/丙酮酸的比值。但是，此时的CZB还必须分成2步使用来克服随机繁育的小鼠胚胎发育阻滞问题，因为葡萄糖存在可能会造成2细胞发育阻滞，因此葡萄糖在4细胞至8细胞阶段引入。经过长时间的研究，现在的CZB已经发展到不需要分成2步来培养胚胎。
KOSM是一种用SOM(Simplex Optimized Medium) 优化法产生的一系列培养液的产物，它可以支持远亲杂交的合子克服2细胞阻滞。SOM中K⁺/Na⁺ 比例较低，在随后的研究中增加了K⁺的浓度使K⁺/Na⁺的比例达到正常值，即KSOM（添加了K⁺的SOM）就是目前我们常用的小鼠胚胎培养液，支持各种品系小鼠胚胎的体内和体外发育。
3、氨基酸的引入
最初小鼠胚胎培养液CZB及KSOM都含有谷氨酰胺，但都没有加入氨基酸。1990s研究者表明一些氨基酸对小鼠的胚胎发育是有益的，而一些氨基酸是有害的。同时，有另外研究者表明Eagle’s 非必须氨基酸是对胚胎发育的卵裂期及植入前的发育有益的。改良后的KSOM称为KSOM-aa,包含20种常见的α-氨基酸，表明可以提高囊胚发育的潜力及质量。
CZB和KSOM中无机离子水平和氨基酸对胚胎发育的影响是相辅相成，相互作用的两者并不能独立对胚胎发育起决定作用。氨基酸中主要是甘氨酸，为了保持的细胞大小取代了细胞内部分无机离子，以防止细胞内离子强度上升到有害水平而阻碍发育。因此，培养基的最佳盐水平、渗透压和氨基酸含量不是独立的，而是它们在细胞体积调节中的相互作用形成的最佳水平。
参考文献
1. Jay M. Baltz，Media Composition: Salts and Osmolality ,chapter 5, DOI: 10.1007/978-1-61779-971-6_5
2. David K. Gardner, Thi T. Truong, Culture of the Mouse Preimplantation Embryo. Part of the Methods in Molecular Biology book series (MIMB, volume 2006) Comparative Embryo Culture pp 13-32, chapter 2. https://doi.org/10.1007/978-1-4939-9566-0_2,
3. David K. Gardner, Dissection of culture media for embryos: the most important and less important components and characteristics. Reproduction, Fertility and Development, 2008, 20, 9–18
4. Nagy，Gersenstein，Vintersten，Behringer，etal. 小鼠胚胎操作实验手册（第三版），2006
最初小鼠胚胎培养液CZB及KSOM都含有谷氨酰胺，但都没有加入氨基酸。1990s研究者表明一些氨基酸对小鼠的胚胎发育是有益的，而一些氨基酸是有害的。同时，有另外研究者表明Eagle’s 非必须氨基酸是对胚胎发育的卵裂期及植入前的发育有益的。改良后的KSOM称为KSOM-aa,包含20种常见的α-氨基酸，表明可以提高囊胚发育的潜力及质量。
CZB和KSOM中无机离子水平和氨基酸对胚胎发育的影响是相辅相成，相互作用的两者并不能独立对胚胎发育起决定作用。氨基酸中主要是甘氨酸，为了保持的细胞大小取代了细胞内部分无机离子，以防止细胞内离子强度上升到有害水平而阻碍发育。因此，培养基的最佳盐水平、渗透压和氨基酸含量不是独立的，而是它们在细胞体积调节中的相互作用形成的最佳水平。
常用小鼠胚胎培养液有哪些？功能区别介绍
表1. 常见培养液功能用途
需要注意的是：胚胎培养液在配制过程中，有些成分需要使用时再添加，有些成分则可以配制成储存液暂存，配制所用的水,保存温度和周期都有严格的要求。不仅这些培养液，还有小鼠胚胎操作中其它常用的试剂，比如受精液HTF, 精子冷冻保护液g-CPA，精子获能液胚胎C-TYH，胚胎冷冻保护剂EFS20/40等在配制及保存都有严格的要求。
用于小鼠胚胎的培养液成分表
表2. 常见培养液的成分表
参考文献
1. Jay M. Baltz，Media Composition: Salts and Osmolality ,chapter 5, DOI: 10.1007/978-1-61779-971-6_5
2. David K. Gardner, Thi T. Truong, Culture of the Mouse Preimplantation Embryo. Part of the Methods in Molecular Biology book series (MIMB, volume 2006) Comparative Embryo Culture pp 13-32, chapter 2. https://doi.org/10.1007/978-1-4939-9566-0_2,
3. David K. Gardner, Dissection of culture media for embryos: the most important and less important components and characteristics. Reproduction, Fertility and Development, 2008, 20, 9–18
4. Nagy，Gersenstein，Vintersten，Behringer，etal. 小鼠胚胎操作实验手册（第三版），2006